Citotoxidade Dependente de Complemento (CDC) – Prova Cruzada

A sensibilização específica contra um doador foi, por muito tempo, causa de grande preocupação em transplante de órgãos, pois poderia levar à rejeição hiperaguda do órgão recebido. A primeira rejeição desse tipo a um transplante renal alogênico foi descrita em 1963. Desde então, as provas cruzadas com linfócitos T e B têm sido utilizadas como critérios de predição de um transplante bem sucedido de órgãos sólidos.

O princípio básico da Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) é o dano da membrana de linfócitos, mediado pelo sistema de complemento, e iniciado por anticorpo que se ligou a um antígeno específico da membrana celular. Nessa prova, faz-se a incubação de linfócitos T e B do doador (obtidos do sangue periférico, linfonodos ou baço, e isolados com o emprego de beads imunomagnéticas e corantes florescentes) com soro do receptor. Se esses linfócitos tiverem em sua superfície um antígeno reconhecido por um anticorpo específico presente no soro do receptor, forma-se um complexo antígeno-anticorpo, que pode ativar a cascata de enzimas do complemento, levando ao dano das membranas das células do receptor. A porcentagem de células danificadas pode ser visualmente determinada pela adição de corantes e observadas por um microscópio de imunofluorescência.

Em uma reação negativa, os linfócitos estão íntegros, vivos, e têm coloração verde. Em uma reação positiva, os linfócitos estão lisados e têm coloração vermelha.

Citometria de Fluxo – Painel de Reatividade Contra Anticorpos (PRA)

A Citometria de Fluxo é uma técnica rápida e precisa utilizada para contar, analisar e classificar simultaneamente partículas microscópicas marcadas por diferentes radicais químicos chamados fluorocromos. Essas partículas, suspensas em um meio líquido, são aspiradas por um aparelho chamado Citômetro de Fluxo, e nele atravessam feixes de raios laser. A energia desses raios excita os fluorocromos, que emitem sinais fluorescentes.

O uso de fluorocromos diferentes em citômetros, com vários lasers e vários fotodetectores, permite medir simultaneamente diversas características de cada partícula (em uma célula, por exemplo) facilitando sua contagem, identificação e análise (Citometria de Fluxo Multiparamétrica).

No LIG Diagnósticos Especializados, a Citometria de Fluxo é usada em conjunto com plataformas Luminex e softwares especiais. Dessa forma, aumenta a rapidez, precisão e a sensibilidade de alguns exames, como a Tipagem HLA molecular, pela análise de DNA ligado a esferas magnéticas marcadas, e também o Painel de Reatividade de Células (PRA), que detecta anticorpos no soro de pacientes à espera de transplante de órgãos.

Para o PRA, o ensaio misto (Mixed) inicial indica se o paciente tem, em seu soro, anticorpos para os antígenos HLA de Classe I e/ou Classe II. A seguir, outros testes diferenciam as especificidades dos anticorpos presentes, confirmadas depois pelo ensaio Single Antigen, também útil para comparar a reatividade de diferentes amostras de soro do mesmo indivíduo, ao longo do tempo.

PCR-SSP – Tipagem HLA

Com o advento das tecnologias de PCR, as técnicas de tipagem HLA baseadas em DNA tornaram-se uma rotina laboratorial. Para a maioria das metodologias baseadas em DNA, o processo de PCR é utilizado apenas como um passo de amplificação para obter muitas cópias do DNA alvo necessário. Após a amplificação, métodos moleculares diversos podem ser usados para discriminar entre os vários alelos dos genes HLA (por exemplo, RFLP, SSOP, dot blot inverso). As tipificações HLA por PCR-SSP são ideais para se obter resultados rápidos e com baixa resolução HLA.

A metodologia de PCR-SSP baseia-se no princípio de que primers de oligonucleótidos com correspondência completa são a forma mais eficaz para amplificar uma sequência alvo, por polimerase Taq recombinante. Os pares de primers são concebidos para apresentar apenas correspondências perfeitas com um único alelo ou grupo de alelos. Sob condições de PCR estritamente controladas, num teste positivo, os pares de primers com correspondência perfeita levam à amplificação das sequências alvo, enquanto que pares de primers sem correspondência não produzem amplificação de outras sequências (teste negativo).

Depois do processo de PCR, os fragmentos de DNA amplificados são separados por eletroforese em gel de agarose e visualizados por coloração com brometo de etídio e exposição a luz ultravioleta. A interpretação dos resultados de PCR-SSP baseia-se na presença ou ausência de um fragmento de DNA amplificado específico. Por conseguinte, uma reação positiva para um alelo ou grupo de alelos de HLA específico é visualizada no gel como um fragmento de DNA amplificado. Como controle, essa banda é comparada com a banda do produto do controle interno e a banda do primer não incorporado, que também passam pela eletroforese no gel.

PCR-SSO – Tipagem HLA

Essa técnica de tipagem molecular utiliza sondas de oligonucleotídeos, específicas para determinadas sequências HLA (SSO). Essas sondas estão ligadas a microesferas marcadas por fluorescência, para identificar diversos alelos HLA presentes na amostra do paciente. O fato de permitir amplificação do DNA alvo, ligado à hibridação e detecção numa mistura de alelos de reação única, torna este método adequado tanto para os testes de pequena escala como para os de grande escala.

O teste aplica a tecnologia Luminex ao método de tipagem de DNA SSO invertido. Primeiro, o DNA alvo é amplificado na PCR, utilizando um primer específico. O produto de PCR é biotinilado, o que lhe permite sua detecção por estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina (SAPE).

PCR-NGS – Tipagem HLA

A tipagem dos genes do antígeno leucocitário humano (HLA) é essencial para o transplante de órgãos e medula óssea, associação desses genes com doenças e análises farmacogenéticas para rastrear a hipersensibilidade a medicamentos. Devido à elevada diversidade de polimorfismos e sequências homólogas nos genes HLA, as tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) que permitem o sequenciamento clonal de genes completos ou quase completos tornaram-se muito úteis para fornecer resultados de maior resolução.

A tecnologia de sequenciamento Illumina, sequenciamento por síntese (SBS), é uma tecnologia de sequenciamento de nova geração (NGS) amplamente adotada em todo mundo. Os sequenciadores e reagentes Illumina suportam sequenciamentos paralelos massivos, usando um método próprio que detecta bases únicas assim que são incorporadas às fitas de DNA sintetizadas.

Um terminador reversível fluorescente é captado assim que cada dNTP é adicionado, e então clivado para permitir a incorporação da próxima base. Cada um dos quatro terminadores ligados ao dNTP estão presentes durante cada ciclo de sequenciamento. O resultado final é um sequenciamento verdadeiro de base-a-base que permite informação precisa para um amplo espectro de aplicações.