Metodologia

« Voltar

ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRAY (CMA) -ARRAY-CGH 750K

CMA por Array-CGH ou Hibridização Comparativa do Genoma é uma técnica de citogenética molecular de alta resolução, capaz de analisar simultaneamente todos os cromossomos e detectar microdeleções e/ou microduplicações neles existentes. Essa técnica é indicada para pacientes que apresentam dismorfias, atraso do desenvolvimento, autismo, abortos, defeitos congênitos ou outras condições.

CMA por Array-CGH possui uma capacidade de resolução muito maior do que a citogenética tradicional, e é recomendada para pacientes que têm cariótipo normal, mas apresentam sintomas de anormalidades, e também para aqueles em que há necessidade de uma investigação molecular mais profunda.

Para comparar, o cariótipo com bandeamento G convencional permite analisar de 400 a 600 regiões (bandas) dos cromossomos. O CMA por Array CGH de 750k analisa 750.000 regiões cromossômicas.

CITOMETRIA DE FLUXO

A Citometria de Fluxo é uma técnica rápida e precisa utilizada para contar, analisar e classificar simultaneamente partículas microscópicas marcadas por diferentes radicais químicos chamados fluorocromos. Essas partículas, suspensas em um meio líquido, são aspiradas por um aparelho chamado Citômetro de Fluxo, e nele atravessam feixes de raios laser. A energia desses raios excitam os fluorocromos, que emitem sinais fluorescentes.

O uso de fluorocromos diferentes em citômetros com vários lasers e vários fotodetectores, permite medir simultaneamente diversas características de cada partícula (em uma célula, por exemplo) facilitando sua contagem, identificação e análise (Citometria de Fluxo Multiparamétrica).

No LIG Diagnósticos Especializados, a Citometria de Fluxo é usada em conjunto com plataformas Luminex e softwares especiais. Dessa forma, aumenta a rapidez, precisão e a sensibilidade de alguns exames, como a Tipagem HLA molecular, pela análise de DNA ligado a esferas magnéticas marcadas, e também o Painel de Reatividade de Células (PRA), que detecta anticorpos no soro de pacientes à espera de transplante de órgãos.

SEQUENCIAMENTO DE SANGER

Chama-se Sequenciamento de DNA ao processo de determinação da sequência das bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) que o constituem. Pode-se sequenciar um fragmento de DNA, que contenha um gene de interesse, sequenciar vários genes selecionados (painel de genes) ou mesmo todo o genoma. As técnicas de sequenciamento genético mais usadas são o Sequenciamento de Sanger e o Sequenciamento de Nova geração.

O sequenciamento de Sanger, ou eletroforese capilar, é um método de sequenciamento de DNA baseado na incorporação de nucleotídeos marcados com fluorescência durante uma replicação in vitro.

Em suma, a partir de uma fita de DNA, e utilizando-se da técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), sintetizam-se milhões de fitas de DNA iguais à primeira. Utiliza-se uma mistura de pares de base (A,T,C,G) do DNA investigado, em conjunto com pares de base modificados (Ax, Tx, Cx, Gx). Quando um dos pares de base modificados é adicionado à fita do DNA pesquisado, a reação para. Ao final, ficamos com pedaços de DNA de diferentes tamanhos, terminados em Ax, Tx, Cx ou Gx. Utilizando-se de métodos computacionais, organizamos esses pedaços de acordo com o tamanho e conseguimos revelar a sequência original do DNA.

O sequenciamento de Sanger  costuma ser usado para análise específica de fragmentos de DNA de algumas centenas de bases.

PCR EM TEMPO REAL

A técnica de PCR (reação em Cadeia de Polimerase), muito usada em nossos dias, consiste na obtenção em laboratório de várias cópias de uma região genética (amplificação), de modo a se ter maior quantidade desse pedaço de DNA para realização de uma análise.

Uma evolução dessa técnica, o PCR em Tempo Real, permite que a amplificação e a detecção do novo fragmento de DNA ocorram simultaneamente, com altíssima sensibilidade, gerando um sinal fluorescente detectável desde o início do processo, e possibilitando a obtenção de um resultado qualitativo e/ou quantitativo de forma rápida e precisa.

O PCR em Tempo Real é especialmente útil no diagnóstico e monitoramento de vários problemas de saúde, como infecções por microorganismos de cultura difícil ou demorada, mesmo em fase latente ou crônica, ou outras situações em que a quantidade de partículas é tão pequena, que não é detectada por métodos que utilizam marcadores como anticorpos, proteínas ou metabólitos. Essa técnica também é de grande importância para diagnóstico de resistência microbiana, câncer e doenças genéticas.

O PCR em Tempo Real pode ser feito com diferentes tipos de material biológico, e favorece a abordagem precoce da doença com terapia específica, reduzindo o tempo de tratamento e aumentando sua eficácia. Também permite o monitoramento da resposta terapêutica, permitindo o ajuste individual da dose do medicamento e diminuindo a ocorrência de efeitos colaterais.

SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO (NGS)

Chama-se Sequenciamento de DNA ao processo de determinação da sequência das bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) que o constituem. Pode-se sequenciar um fragmento de DNA, que contenha um gene de interesse, sequenciar vários genes selecionados (painel de genes) ou mesmo todo o genoma. As técnicas de sequenciamento genético mais usadas atualmente são o Sequenciamento de Sanger e o Sequenciamento de Nova geração.

Sequenciamento de Nova Geração

Existem diversos tipos de sequenciamentos de nova geração (Next Generation Sequencing – NGS). Um dos mais utilizados é realizado em micro-chips, com milhões de mini-bolsos, cada um com o tamanho necessário para caber uma molécula de DNA. Esse micro-chip é levado a um computador, juntamente com enzimas específicas. O chip é lavado sequencialmente com pares de base coloridas e cada uma brilha quando encontra o seu par na molécula de DNA em análise. Um computador consegue ler todos esses milhões de pontos coloridos brilhantes que aparecem ao mesmo tempo no chip. É um processo automatizado, que consegue sequenciar milhares de pedaços de DNA de uma só vez. Dessa forma, o custo e o tempo para o sequenciamento do DNA podem ser bem menores, em comparação ao sequenciamento de Sanger.

O NGS pode ser usado para sequenciamento completo de um gene, mas é especialmente útil na pesquisa simultânea de um grupo de genes selecionados, relacionados a algum distúrbio específico. Também é usado para análise do exoma (conjunto dos éxons – genes que são transcritos) e mesmo de todo o genoma (conjunto de todo o material genético) do indivíduo. Mutações detectadas por NGS geralmente passam por confirmação por Sanger, que é o padrão ouro, ou outro método.

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - Amplificação de Múltiplas Sondas Dependente de Ligação)

MLPA é um método sensível, econômico e rápido para detecção de deleções e duplicações em regiões gênicas específicas. Para esse exame, a amostra de DNA genômico é hibridizada a uma mistura de sondas, com amplificação posterior dos produtos de ligação por PCR. Os fragmentos finais são separados e lidos em aparelho de eletroforese capilar, sendo possível a quantificação relativa das cópias gênicas.

Essa técnica é bastante útil para detectar ganho ou perda de sequências pequenas de 50-70 nucleotídeos, mas não detecta alterações no número de cromossomas, alterações estruturais cromossômicas equilibradas, nem contaminação celular materna em amostras XX.

O MS-MLPA (MLPA Específico da Metilação) é uma variante da técnica convencional de MLPA, que permite detectar, além do número de cópias gênicas, também o padrão de metilação do gene. É um método útil para evidenciar metilação em doenças de imprinting, como Prader Willi / Angelman e Beckwith Wiedemann, e para examinar metilação aberrante em amostras de tumor. Essas aberrações são responsáveis por inativação transcricional de genes supressores de tumor, e podem levar à progressão tumoral ou à resistência a agentes quimioterápicos.